PCR疑难问题粉碎机(一)——终点PCR

发布者:艾美捷科技发布时间:2020-06-10

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        1.PCR的概念

 

      PCR,即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成:即模板DNA先经高温变性为单链,在DNA聚合酶和适宜的温度下,两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)为底物,使退火引物得以延伸,如此反复,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。

 

模板DNA

 

       2.PCR的分类

 

      PCR有很多种,核心就是用引物扩增特定的DNA,以指数方式倍增的DNA达到可以观察到的量后,通过不同的观察方法比较DNA相对表达的高低。根据检测方式的不同,分为终点 PCR(也即常规PCR)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR),根据样本类型的不同,还包括以RNA为模板的反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)。

 

PCR分类

 

 

终点PCR

 

      终点PCR,顾名思义既是对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析,在反应过程中无法监测反应进行情况,只有反应完成后通过跑胶得到结果。

 

       1.热启动PCRhot start PCR

 

       在传统的PCR反应中,反应体系各成分(Taq DNA聚合酶、dNTP 和引物等)均是一次加入并进入循环,在反应温度由室温(25℃)上升至高温(94~95℃)过程中,可能发生引物错配和二聚体的形成。引物与模板中一些非靶位点的错配和引物之间形成的二聚体,在Taq酶的作用下均可延伸,这些非特异性产物又可以在后面的PCR循环中继续扩增,使非特异性产物不断积累,同时,也消耗反应体系的各成分,最终PCR扩增的特异性产物大大减少。热启动PCR(hot start PCR)是指DNA聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR。通过这种方式控制PCR反应的必须组分DNA聚合酶,直到反应混合物被加热到可以阻止非特异引导和引物聚合的温度后,再启动PCR达到有效扩增特异性PCR产物的目的。

 

      *UNG酶通常和热启Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染体系的热启动PCR反应系统。

 

      UNG酶(Uracil-N-glycosylase,尿嘧啶-N-糖基化酶)的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键,形成的有缺失碱基的DNA链在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂,从而被消除。UNG酶的最佳活性温度为50℃,95℃灭活。作用:为保证PCR结果的准确性,要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和Taq 酶热启动。PCR反应最常见,最重要的污染物是PCR产物,防污染热启动PCR试剂盒以dUTP取代dTTP,所以PCR产物都是含有dU的DNA链。在PCR开始前增加50℃的保温步骤,UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解,并在随后变性这步的条件下DNA链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增,从而保证扩增结果的特异性,准确性。

 

       2.高保真PCR

 

      Taq酶具有5'-3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性,缺少3'→5'的外切酶活性,但没有从3'→5'方向外切酶的活性,扩增得到的PCR产物的3'末端附有一个“A”碱基,可直接用于TA克隆,但是由于不具有3'→5'外切酶活性,因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。DNA聚合酶的校正能力决定了保真度,会影响DNA序列复制的准确性。Solis Biodyne提供的blend mix同时包含Taq酶和校正酶,使得PCR反应既具有5'→3'方向合成DNA的功能,又具有3'→5'方向外切酶的活性和纠错功能。

 

       3.多重PCR

 

      多重PCR是指在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的 PCR反应。多重PCR不仅意味着节省时间、试剂和样品,还能够同时对比多个扩增子。

 

      在多重PCR中,因无法仅针对一个引物对或目的片段进行反应优化,而是要考虑到所有引物和靶标,所以可能会出现非特异性扩增和效率降低。因此,为尽量减少由非特异性扩增导致的错配,应对引物进行精心设计。首先,引物序列应尽可能与其目的序列一一对应,并且所有引物的 Tm相差不应超过5°C。其次,在多重PCR开始前,应利用单个PCR反应验证每个引物对的特异性和扩增效率。此外,扩增子应具有不同的大小,从而能够通过凝胶电泳对其进行分离鉴定。

 

多重PCR

 

      4.长片段PCR

 

      常规PCR反应可以扩增到3~4kb的DNA片段,而超过5kb的DNA片段就已经很难扩增出来了。长片段PCR即是指扩增大于5kb的DNA片段。NCBI推荐的基因克隆供应商GeneCopoeia可提供长片段PCR试剂盒,可扩增18kb人来源gDNA以及30kb λ噬菌体DNA为模板等大片段DNA,同时可扩增高GC%片段,适用范围广,实验过程中仅需添加引物与模板,操作简便。

 

长片段PCR

 

      5.高GC含量PCR

 

      在DNA(A、T、C、G)4种碱基中,鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率称为GC含量。因为G、C之间形成三对氢键,解链所需能量较高,所以模板很难打开,高GC含量(G+C≥60%)模板扩增中所面临的主要困难是模板中容易形成稳定的二级结构妨碍DNA聚合酶在模板上的推进,而且模板上可能存在多个非特异性的引物复性位点,导致非特异性扩增,甚至很多时候扩增不出靶基因。Solis BioDyne可专业提供专业的高GC含量模板的PCR增强剂和预混液,可适用于GC含量高至79%的模板,轻松解决高GC含量PCR的难题。

高GC含量PCR

 

类型 货号 名称
常规PCR 01-01-00500 FIREPol® DNA Polymerase (5 U/ul) DNA聚合酶(5 U/ul)
04-12-00115 5*FIREPol® Master Mix Ready to Load with 12.5 mM MgCl2 5*PCR预混液,含染料
热启动PCR DNA聚合酶 01-02-00500 HOT FIREPol® DNA Polymerase (5 U/μl) 热启动DNA聚合酶
高保真PCR 04-25-00115 5xHOT FIREPol® Blend Master Mix Ready to Load with 12.5 mM MgCl2 5*高保真酶PCR预混液,含染料
多重PCR 04-36-00120 5xHOT FIREPol® MultiPlex Mix Ready To Load with 10 mM MgCl2 5*多重PCR预混液,含染料
高GC含量PCR 04-33-00115 5xHOT FIREPol GC Master Mix 5*高GC含量模板PCR预混液
快速PCR 24-02-00001 SolisFAST™ Master Mix Ready To Load 快速PCR预混液,含染料
24-22-00001 SolisFAST™ Master Mix with UNG Ready To Load 快速PCR预混液,含UNG酶,含染料
长片段PCR PC002 长片段PCR试剂盒(18kb gDNA/30kb λDNA)
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